Domanda:
Come si rompono i grumi cellulari durante il passaggio?
Rob O'Callahan
2011-12-22 07:55:37 UTC
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Sto lavorando con le cellule HepG2 e a loro piace molto formare grumi. Il pipettaggio su e giù in TrypLE non sembra essere molto efficace per scomporli.

Rob: Google può rispondere a questa domanda? Se è possibile, torna indietro e pubblica una risposta alla tua domanda. Ecco un suggerimento: http://hepg2.com/index.html
Tre risposte:
#1
+5
Jeremy
2012-01-17 09:40:10 UTC
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Trovo che ricevo grumi (con HeLa e tipi di cellule simili) solo se li lascio in Tryple troppo a lungo. Generalmente li lascio a temperatura ambiente (non caldi) Tryple per ~ 8 minuti, quindi inclino il piatto senza il coperchio in modo da poter vedere la "lucentezza" delle celle sul piatto (questo accade ovviamente nella cappa ). Quindi faccio esplodere la lucentezza con Tryple usando un pipettatore da 1000 ul, che disaderisce le cellule. Questi sono generalmente molto meno raggruppati che se lasciassi che il Tryple de-aderisse alle celle.

#2
+3
kasia
2012-01-15 19:52:12 UTC
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In alcuni protocolli per la creazione di colture primarie (ad esempio dal midollo osseo di topo o dall'endometrio di ratto), c'è un passaggio che richiede di spingere la sospensione cellulare attraverso un grande ago per eliminare i grumi. Naturalmente, questo comporta un alto rischio di danneggiare le cellule, quindi a volte viene utilizzata invece la collagenasi.

Potrebbe anche essere utile lavare le cellule con PBS senza ioni prima del passaggio e utilizzare tripsin con EDTA. Questo dovrebbe eliminare almeno un po 'di calcio dalla piastra, in modo che l'azione delle proteine ​​di adesione sarebbe inibita.

#3
+3
Valentinos
2012-02-17 21:28:23 UTC
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I grumi cellulari che non si dissociano con un pipettaggio rigoroso potrebbero benissimo essere causati dal DNA libero nella sospensione cellulare (ad es. se tripsinizzato per troppo tempo). Il DNA libero attrae le cellule che si legano insieme formando grumi.

Due possibili modi per sbarazzarsi di questi grumi:

  1. Centrifugare la sospensione cellulare a 5000 rpm per 2 minuti con l'accelerazione attivata (in 4) e freno (in 3) permettendo alle molecole più pesanti di precipitare. Quindi aspirare ~ 0,5 ml dalla sommità della sospensione e trasferire in un nuovo pallone. Ripeti se necessario.
  2. Usa DNAse a concentrazioni comprese tra 20 e 100 µg / ml (concentrazione risultante dall'uso personale) fintanto che non intendi eseguire esperimenti relativi al DNA.

Puoi sempre tornare indietro e acquistare una nuova fiala della linea cellulare che desideri senza grumi :)



Questa domanda e risposta è stata tradotta automaticamente dalla lingua inglese. Il contenuto originale è disponibile su stackexchange, che ringraziamo per la licenza cc by-sa 3.0 con cui è distribuito.
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