Domanda:
Perché le proteine ​​non sono visibili sulla mia membrana dopo la colorazione con ponceau?
Anael
2015-03-26 17:55:00 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Ho un problema con il western blot che non riesco a risolvere da solo. Quando aggiungo 100 microgrammi di proteine ​​per ogni campione, ma dopo la corsa e il trasferimento non riesco a vedere le bande di proteine. la ragione di ciò? Grazie per il tuo aiuto enter image description here

Che tipo di proteine ​​stai usando: estratti cellulari interi o campioni purificati? Quali sono le tue condizioni di corsa e trasferimento? Hai provato a colorare il gel con il blu coomassie per assicurarti di avere un campione sul gel? Come misuri le tue proteine? Quali sono i buffer in cui misuri?
quindi ho bisogno di quantificare la globina che è una proteina di 16 kda. Ho estratto le mie proteine ​​dalle cellule MEL dopo il trattamento utilizzando la lisi tampone e gli inibitori delle proteine. Faccio la corsa a 80 volt in tampone di corsa (tris, glicina) e poi eseguo un travaso a umido per un'ora con tampone di trasferimento (tris, glicina, metanolo). Non ho pensato di macchiare il gel ma in realtà è una buona idea che dimostrerà se il mio problema nella fase di corsa o trasferimento ... Per misurare le mie proteine ​​sto usando il metodo Bradford quando i miei Lysat sono in 200 micro litri di tampone di lisi.
Questa macchia ha mai funzionato prima? Cosa c'è nel tuo buffer di lisi, per caso SDS o qualcosa di simile DTT?
Prima stavo usando una lisi tampone tris-tritone, poi uso una lisi tampone che contiene tris, tritone, NaCl, EDTA e. Provo a usare in un'altra macchia e lo stesso risultato: posso vedere la banda delle proteine ​​solo nella parte superiore ...
Cosa intendi quando vedi le proteine ​​solo nella parte superiore?
Vedo bande dopo la colorazione del ponceau solo sulla parte superiore della membrana
Che percentuale ha il tuo gel?
È un gel al 15%.
Hai bollito o denaturato i tuoi campioni prima di caricarli?
Sì, ho bollito i miei campioni per 5 minuti dopo aver aggiunto il tampone del campione
Due risposte:
Chris
2015-03-26 18:58:18 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Da quello che dici, posso solo dare alcuni consigli:

  1. Per la quantificazione, assicurati che il tuo campione non contenga sostanze che disturbano il dosaggio. Il test di Bradford è ad esempio sensibile contro SDS o DTT. Vedi qui per maggiori dettagli. Questo ti impedisce di caricare un campione senza abbastanza proteine.
  2. Assicurati di avere davvero proteine ​​sul tuo gel. Applicare un gel come di consueto e poi colorarlo con Coomassie Blue (non può essere utilizzato per il western in seguito).
  3. Non perdere il campione: questo accade più facilmente di quanto la maggior parte delle persone pensi.
  4. Assicurati che il trasferimento funzioni. Questo può essere fatto utilizzando scale pre-colorate (che sono comunque utili) o applicando la colorazione Ponceau Red. Può essere lavato via con acqua e non disturba le applicazioni a valle.
  5. A seconda del tipo di membrana che stai utilizzando, potrebbe essere necessario un pretrattamento. Le membrane in PVDF sono estremamente idrofobiche e devono essere attivate in metanolo.
Grazie, controllerò la lisi del tampone. Come posso essere sicuro che non perderò solo le proteine?
Ciao Chris, ho unito alla domanda una foto della mia membrana dopo ponceau se puoi dare un'occhiata.
Daremo un'occhiata più da vicino più tardi. Puoi dirmi la dimensione del pennarello (le 4 o 5 bande inferiori sono sufficienti).
È un indicatore di 10-250 kd di banda 10
Non vedo nessuna band qui, ma solo una macchia. Per prima cosa sospetto la degradazione del tuo campione. Sarebbe davvero importante eseguire semplicemente un gel e macchiarlo per vedere come appare e per scoprire il passaggio problematico qui. Probabilmente è già il gel ...
Ho anche pensato che il problema fosse nei campioni ma non so dov'è il mio problema ... Per preparare il mio campione lavo prima le mie cellule con pbs.Dopo aver rimosso il liquido superiore aggiungo la lisi tampone e poi faccio un congelamento / scongelamento dei miei campioni in azoto liquido e quindi centrifugazione a 14.000 giri / min per 20 minuti ....
Usi inibitori della proteasi nel tuo tampone di lisi? In caso contrario, questo potrebbe essere il motivo per cui il campione è degradato. Come ho scritto, userei un gel, lo colorerei e vedrei come appare.
Sì, sto aggiungendo pmvf e un cocktail di inibitori della proteasi ...
Grazie mille Chris, ho intenzione di colorare il gel con il blu coomassie oggi!
Anael
2015-03-31 09:15:09 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Dopo aver verificato così tante possibilità, finalmente risolvo il problema. Si è scoperto che il ph del tris 1,5M per la preparazione del gel era troppo basilare ... il che spiega una macchia di proteine ​​nel gel



ⓘ
Questa domanda e risposta è stata tradotta automaticamente dalla lingua inglese. Il contenuto originale è disponibile su stackexchange, che ringraziamo per la licenza cc by-sa 3.0 con cui è distribuito.
Loading...